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详细信息

新品推荐:动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒

 主要用途

 

动物细胞/组织活性线粒体分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的活性线粒体细胞器的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织(肝或脑组织)和培养细胞的活性线粒体的制备。其制备物产量高,活性保证,可以被用于线粒体酶活性、细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶,即到即用,性能稳定,分离产量和纯度高。

 

技术背景

 

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的最常用的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用:第一,通过机械或化学方法破裂细胞;第二,通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器;第三,通过高速差速离心获得线粒体;甚至,第四,可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A   100毫升

裂解液(Reagent B    40毫升

净化液(Reagent C    10毫升

强化液(Reagent D     5毫升

保存液(Reagent E   100毫升

活性液(Reagent F   200微升

产品说明书 1

 

保存方式

 

保存净化液(Reagent C)和活性液(Reagent F)在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里,有效保证6

 

用户自备

 

HANK平衡盐缓冲溶液(12028)或PBS缓冲溶液(12033):用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液(12024):用于细胞脱离

完全细胞培养液(12052):用于中和胰蛋白酶的细胞培养基

15毫升锥形离心管:用于线粒体初步制备物的存放

50毫升锥形离心管:用于细胞或组织收集后离心或清洗

1.5毫升离心管:用于保存线粒体

4℃台式离心机:用于沉淀细胞

4℃超速离心机:用于分离细胞器成分

DOUNCE匀浆器:用于裂解细胞

实验步骤

 

一、动物软组织线粒体分离(组织匀浆法)

 

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F冻融,然后移出20微升活性液(Reagent F1毫升净化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升锥形离心管里,混匀后,标记为裂解工作液,放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

 

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(1克组织需要5毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 即刻用刀片切碎组织

5. 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6. 加入预冷的5毫升裂解工作液

7. 涡旋震荡5秒,充分混匀

8. 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用匀浆棒匀化组织(约2040下)(注意:参见注意事项8

9. 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

10. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

11. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

12. 放进4超速离心机离心10分钟,速度为10000g

13. 小心抽去上清液,保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

14. (选择步骤)加入预冷的3毫升保存液(Reagent E

15. (选择步骤)放进4超速离心机再次离心5分钟,速度为10000g

16. (选择步骤)小心抽去上清液

17. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混匀

18. 即刻移入1.5毫升离心管,放进-70冰箱里

 

二、动物软组织线粒体分离(化学处理法)

 

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F冻融,然后移出20微升活性液(Reagent F1毫升净化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升锥形离心管里,混匀后,标记为裂解工作液,放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

 

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量(注意:实验前最好使动物空腹1224小时

2. (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(1克组织需要5毫升)清理液(Reagent A清洗1

4. 移入一个液氮冻存管

5. 即刻放进液氮罐过夜

6. 次日从液氮罐里取出,即刻(最快速度)碾碎组织(注意:切莫使组织冻融

7. 放进一个15毫升锥形离心管

8. 加入预冷的5毫升裂解工作液

9. 涡旋震荡5秒,充分混匀

10. 在冰槽里孵育2分钟,其中每间隔一分钟涡旋震荡5

11. 加入预冷的500微升强化液Reagent D

12. 涡旋震荡5秒,充分混匀

13. 在冰槽里孵育5分钟,其中每间隔一分钟涡旋震荡5(注意:参见注意事项9

14. 加入预冷的5毫升保存液(Reagent E,用手混匀

15. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

16. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

17. 放进4超速离心机离心10分钟,速度为10000g

18. 小心抽去上清液,保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

19. (选择步骤)加入预冷的3毫升保存液(Reagent E

20. (选择步骤)放进4超速离心机再次离心5分钟,速度为10000g

21. (选择步骤)小心抽去上清液

22. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混匀

23. 即刻移入1.5毫升离心管,放进-70冰箱里

 

三、动物细胞线粒体分离(细胞匀浆法)

 

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F冻融,然后移出20微升活性液(Reagent F1毫升净化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升锥形离心管里,混匀后,标记为裂解工作液,放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

 

1. 准备51075cm2细胞培养瓶的细胞(5 X 107),直至细胞生长铺满整个培养表面

2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶,覆盖培养瓶表面,

3. 小心抽去清洗液

4. 重复实验步骤23一次

5. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养平面

6. 放进37培养箱孵育3分种

7. 手击震动培养瓶,使细胞脱落

8. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

9. 全部移入到一个50毫升锥形离心管

10. 放进台式离心机离心10分钟,速度为200g

11. 小心抽去上清液

12. 加入10毫升预冷的清理液(Reagent A),混匀细胞

13. 放进台式离心机离心10分钟,速度为300g

14. 小心抽去上清液

15. 加入预冷的5毫升裂解工作液

16. 涡旋震荡5秒,充分混匀细胞颗粒群

17. 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用匀浆棒匀化细胞(约2040下)(注意:参见注意事项8

18. 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

19. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

20. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

21. 放进4超速离心机离心10分钟,速度为10000g

22. 小心抽去上清液,保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

23. (选择步骤)加入预冷的3毫升保存液(Reagent E

24. (选择步骤)放进4超速离心机再次离心5分钟,速度为10000g

25. (选择步骤)小心抽去上清液

26. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混匀

27. 即刻移入1.5毫升离心管,放进-70冰箱里

 

四、动物细胞线粒体分离(化学处理法)

 

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F冻融,然后移出20微升活性液(Reagent F1毫升净化液(Reagent C4毫升的裂解液(Reagent B15毫升锥形离心管里,混匀后,标记为裂解工作液,放进冰槽里备用。然后进行下列操作。

 

1. 准备51075cm2细胞培养瓶的细胞(5 X 107),直至细胞生长铺满整个培养表面

2. 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐溶液或PBS溶液到每个细胞培养瓶,覆盖培养瓶表面

3. 小心抽去清洗液

4. 重复实验步骤23一次

5. 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,铺满整个培养平面

6. 放进37培养箱孵育3分种

7. 手击震动培养瓶,使细胞脱落

8. 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液

9. 全部移入到一个50毫升锥形离心管

10. 放进台式离心机离心10分钟,速度为200g

11. 小心抽去上清液

12. 加入10毫升预冷的清理液(Reagent A

13. 放进台式离心机离心10分钟,速度为300g

14. 小心抽去上清液

15. 加入预冷的5毫升裂解工作液

16. 涡旋震荡5秒,充分混匀

17. 在冰槽里孵育2分钟,其中每间隔一分钟涡旋震荡5

18. 加入预冷的500微升强化液Reagent D

19. 涡旋震荡5秒,充分混匀

20. 在冰槽里孵育5分钟,其中每间隔一分钟涡旋震荡5(注意:参见注意事项9

21. 加入预冷的5毫升保存液(Reagent E,用手混匀

22. 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g

23. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

24. 放进4超速离心机离心10分钟,速度为10000g

25. 小心抽去上清液,保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

26. (选择步骤)加入预冷的3毫升保存液(Reagent E

27. (选择步骤)放进4超速离心机再次离心5分钟,速度为10000g

28. (选择步骤)小心抽去上清液

29. 加入1毫升保存液(Reagent E,充分混匀

30. 即刻移入1.5毫升离心管,放进-70冰箱里

 

注意事项

 

1. 本产品为10次(1克动物组织或5 X 107细胞)或50次(200毫克动物组织或1 X 107细胞)操作

2. 实际操作的动物组织重量或细胞量与试剂使用量按比例调整:例如200毫克动物组织:试剂用量是标准用量的五分之一

3. 所有操作均须在4或以下状态进行

4. 操作时,须戴手套

5. 操作时,须无菌操作,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B保存液(Reagent E

6. 建议使用足够的样品量

7. 建议严格控制操作时间

8. 通常匀化次数为2040下(或细胞颗粒群/组织块状消失为止)达到80%的细胞裂解为理想状态,但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度:完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加匀化次数

9. 通常孵育5分钟(不宜超过5分钟)达到80%的细胞裂解为理想状态,但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度:完整细胞呈现发亮的圆环。低于50%可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

10. 对于难以裂解的细胞,例如HeLa细胞,采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理

11. 通常5 X 107细胞或1克动物组织的线粒体含量为50微克以上线粒体蛋白

12. 如果需要计量线粒体,稀释后数分钟内完成,否则线粒体将分解

13. 本产品所获得的线粒体纯度和产量最为理想。通过调整10000g离心速度到30008000g,可以提高粗提的线粒体纯化程度,但线粒体产量相应减少

14. 如果需要获得99%以上纯度的线粒体,使用动物细胞/组织高质纯化线粒体分离试剂盒10006.3

15. 线粒体正常活性测定方法是: CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等

16. 线粒体内外膜完整测定方法是:CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色

17. 本公司提供线粒体套餐:ROSNAOMitoTRACKJGB、线粒体溶解等

18. 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整

3. 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性

4. 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶

 

使用承诺

 

本公司秉着信誉至上、客户满意、质量承诺的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后,应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定,保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题,请立即以书面形式(实验报告)与本公司联系,并将该产品退回,经检验确系产品质量所致,本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致,本公司不承担由此造成的损失。

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